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熒光和熒光壽命
分子包含多個(gè)單能態(tài)S0、S1、S2…和三重態(tài)T1…，每個(gè)能態(tài)都包含多個(gè)精細的能級。正常情況下，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級上，當分子被光束照射，會(huì )吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時(shí)間，便會(huì )通過(guò)內轉換過(guò)程躍遷到S1 上，而S1 能態(tài)上的電子亦會(huì )在極短時(shí)間內躍遷到S1 的*低能級上，而這些電子會(huì )存在一段時(shí)間后通過(guò)震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個(gè)過(guò)程會(huì )釋放一個(gè)光子，即熒光。
此外，亦會(huì )有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài)，我們稱(chēng)之為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時(shí)，主要在以下幾方面進(jìn)行分析：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜、熒光強度、偏振熒光、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時(shí)間（納秒量級）。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類(lèi)測試方法：時(shí)域測量和頻域測量時(shí)間穩定性實(shí)驗測試曲線(xiàn)：
1 時(shí)域測量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1，接著(zhù)測量熒光的發(fā)射幾率隨時(shí)間的變化。其中目前廣泛應用的是時(shí)間相關(guān)單光子計數，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時(shí)間相關(guān)單光子計數(TCSPC) 實(shí)現了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試，此方法對數據的獲取*依賴(lài)快速探測器和高速電路。用統計的方法計算樣品受激后發(fā)出的第一個(gè)( 也是*一的一個(gè)) 光子與激發(fā)光之間的時(shí)間差，也就是下圖的START( 激發(fā)時(shí)刻) 與STOP( 發(fā)光時(shí)刻) 的時(shí)間差。由于對于Stop 信號的要求，所以TCSPC 一般需要高重復頻率的光源作為激發(fā)源，其重復至少要在100KHz 以上，多數的光源都會(huì )達到MHz 量級；同時(shí)，在一般情況下還要對Stop 信號做數量上的控制，做到盡量滿(mǎn)足在一個(gè)激發(fā)周期內，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個(gè)光子的有效熒光信號，避免光子對的出現。
2 頻域測量
對連續激發(fā)光進(jìn)行振幅調制后，分子發(fā)出的熒光強度也會(huì )受到振幅調制，兩個(gè)調制信號之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差，因此可以測量該相位差計算熒光壽命。
左圖為正弦調制激發(fā)光（綠色）頻域顯示，發(fā)射光信號（紅色）相應的相位變化頻域顯示。
右圖為對應不同壽命的調制和相位的頻域顯示。TM- 調制壽命，TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）
顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一種在顯微尺度下展現熒光壽命空間分布的技術(shù)，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無(wú)法代替的優(yōu)異性能，目前在生物醫學(xué)工程、光電半導體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段。
FLIM 一般分為寬場(chǎng)FLIM 和激光掃描FLIM。
寬場(chǎng)FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號，再由一寬場(chǎng)相機采集熒光成像。寬場(chǎng)FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時(shí)域或是頻域壽命采集都可以應用在寬場(chǎng)成像FLIM 上。寬場(chǎng)FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對選定區域內的樣品逐點(diǎn)獲取其熒光衰減曲線(xiàn)，再經(jīng)過(guò)擬合最終合成熒光壽命圖像。相比寬場(chǎng)FLIM，其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優(yōu)勢。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動(dòng)激光進(jìn)行掃描，一種是固定激光，電動(dòng)位移臺帶動(dòng)樣品移動(dòng)進(jìn)行掃描。
超快熒光測試系統FLIM應用
材料科學(xué)領(lǐng)域寬禁帶半導體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
量子點(diǎn)如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測
銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽(yáng)能電池的組分、缺陷檢測
鑭系上轉換納米顆粒
GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴散研究
生命科學(xué)領(lǐng)域
細胞體自身熒光壽命分析
自身熒光相對熒光標記的有效區分
活細胞內水介質(zhì)的PH 值測量
局部氧氣濃度測量
具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標記的區分
活細胞內鈣濃度測量
時(shí)間分辨共振能量轉移（FRET）：納米級尺度上的遠差測量，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
超快熒光測試系統FLIM應用案例
1 用熒光分子對海拉細胞進(jìn)行染色
用熒光分子轉子Bodipy-C12 對海拉細胞（宮頸癌細胞的一種） 進(jìn)行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍色）到2.5ns（紅色）；
(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細胞中其他位置壽命較長(cháng)，在1.8ns 附近。
用熒光分子轉子的時(shí)間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標簽特性，且與熒光團的濃度無(wú)關(guān)。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽命是熒光團到金表面距離的函數；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標記乳腺腺癌細胞的細胞膜的共聚焦xz 橫截面，垂直比例尺：5m；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表面附近的GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽(yáng)能電池
下圖研究中，展示了一種動(dòng)態(tài)熱風(fēng)（DHA）制備工藝來(lái)控制全無(wú)機PSC 的薄膜形態(tài)和穩定性，該工藝不含有常規的有害反溶劑，可以在大氣環(huán)境中制備。同時(shí)，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（BaI2:CsPbI2Br）。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結晶，從而形成穩定的全無(wú)機PSC。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相。經(jīng)過(guò)DHA處理的鈣鈦礦光伏器件，在0.09cm小面積下，效率為14.85%，在1x1cm的大面積下，具有13.78%的*高效率。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍寶石和(b) GaN 上生長(cháng)的MQWs 的共焦PL mapping 圖像。具有較小尺寸的發(fā)光團的最高密度是觀(guān)察到在GaN 上生長(cháng)的MQWs。在(c) 藍寶石和(d)GaN 上生長(cháng)的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對于在GaN 上生長(cháng)的MQWs，強的PL 強度區域與較長(cháng)PL 衰減時(shí)間的區域很好地匹配。在(e) 藍寶石和(f)GaN 上生長(cháng)的MQWs 在A(yíng) 點(diǎn)和B 點(diǎn)測量的局部PL 衰減曲線(xiàn)，均標記在圖中。對于在GaN 上生長(cháng)的MQWs，點(diǎn)A 和B 之間的PL 衰減時(shí)間差更高。
參數配置
北京卓立漢光儀器有限公司提供的顯微熒光壽命成像系統是基于顯微和時(shí)間相關(guān)單光子計數技術(shù)，配合高精度位移臺得到微觀(guān)樣品表面各空間分布點(diǎn)的熒光衰減曲線(xiàn)，再經(jīng)過(guò)用數據擬合，得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像。是光電半導體材料、熒光標記常用熒光分子等類(lèi)似熒光壽命大多分布在納秒、幾十、幾百納秒尺度的物質(zhì)的選擇。
參數指標：
系統性能指標 | |
光譜掃描范圍 | 200-900nm |
最小時(shí)間分辨率 | 16ps |
熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
配置參數 | |
激發(fā)源及匹配光譜范圍 （光源參數基于 50MHz 重復頻率） | 375nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：30ps，平均功率1.5mW，熒光波段：400-850nm |
405nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：25ps，平均功率2.5mW，熒光波段：430-920nm | |
450nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：50ps，平均功率1.9mW，熒光波段：485-950nm | |
488nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：70ps，平均功率1.3mW，熒光波段：500-950nm | |
510nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：75ps，平均功率1.1mW，熒光波段：535-950nm | |
635nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：65ps，平均功率4.3mW，熒光波段：670-950nm | |
660nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：60ps，平均功率1.9mW，熒光波段：690-950nm | |
670nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：40ps，平均功率0.8mW，熒光波段：700-950nm | |
科研級正置顯微鏡 | 落射明暗場(chǎng)鹵素燈照明，12V，100W 5 孔物鏡轉盤(pán)，標配明場(chǎng)用物鏡：10×，50×，100× 監視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有效像素：1280H*1024V，掃描方式：逐行，快門(mén)方式：電子快門(mén) |
電動(dòng)位移臺 | 高精度電動(dòng)X(jué)Y 樣品臺，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， 最小步進(jìn)：50nm，重復定位精度：＜ 1μm |
光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀，雙入口、狹縫出口、CCD 出口， 配置三塊68×68mm 大面積光柵，波長(cháng)準確度：±0.1nm， 波長(cháng)重復性：±0.01nm，掃描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h)， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續電動(dòng)可調 |
探測器：制冷型紫外可見(jiàn)光電倍增管，光譜范圍：185-900nm（標配，可擴展） | |
光譜CCD （可擴展PLmapping） | 低噪音科學(xué)級光譜CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測面：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片， 低暗電流，*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度，風(fēng)冷，最高量子效率值>95% |
時(shí)間相關(guān)單光子計數器（TCSPC） | 時(shí)間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時(shí)間＜ 10ns， *高65535 個(gè)直方圖時(shí)間窗口，瞬時(shí)飽和計數率：100Mcps，支持穩態(tài)光譜測試； |
OmniFluo-FM 熒光壽命成像專(zhuān)用軟件 | 控制功能：控制樣品平移臺移動(dòng)，通過(guò)顯微鏡的明場(chǎng)光學(xué)像定位到合適區域， 框選掃描區域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線(xiàn)，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等 數據處理功能：自動(dòng)對掃描獲得的FLIM 數據，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合 （組分數小于等于4），對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖、色表、等高線(xiàn)、截線(xiàn)分析、3D 顯示等 |
操作電腦 | 品牌操作電腦，Windows 10 操作系統 |
軟件界面
控制測試界面
測試軟件的界面遵循“All In One"的簡(jiǎn)潔設計思路，用戶(hù)可在下圖所示的控制界面中完成采集數據的所有步驟：包括控制樣品平移臺移動(dòng)，通過(guò)顯微鏡的明場(chǎng)光學(xué)像定位到合適區域，框選掃描區域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線(xiàn)，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等。
數據處理界面
功能豐富的熒光壽命數據處理軟件，充分挖掘用戶(hù)數據中的寶貴信息?？勺詣?dòng)對掃描獲得的FLIM 數據，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合（組分數小于等于4），對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示。
自主開(kāi)發(fā)的一套時(shí)間相關(guān)單光子計數（TCSPC）熒光壽命的擬合算法，可對熒光衰減曲線(xiàn)中最多包含4 個(gè)時(shí)間組分的熒光過(guò)程進(jìn)行擬合，獲得每個(gè)組分的熒光壽命，光子數比例，計算評價(jià)函數和殘差。TCSPC 熒光壽命通常并非簡(jiǎn)單的指數衰減過(guò)程，而是與光源及探測器相關(guān)的儀器響應函數（IRF）與熒光衰減過(guò)程相互卷積的結果，因此適當的擬合方法和參數選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導入實(shí)際測量的IRF 對衰減曲線(xiàn)進(jìn)行卷積計算和擬合。但是大多數情況下， IRF 很難正確的從實(shí)驗獲得，針對這種情況，軟件提供了兩種無(wú)需實(shí)驗獲取IRF 的擬合方法：
1.通過(guò)算法對數據上升沿進(jìn)行擬合，獲得時(shí)間響應函數IRF，然后對整條衰減曲線(xiàn)進(jìn)行卷積計算和擬合得到熒光壽命。
2.對于衰減時(shí)間遠長(cháng)于儀器響應時(shí)間的，可對衰減曲線(xiàn)下降沿進(jìn)行直接的指數擬合。該軟件經(jīng)過(guò)大量測試，可以很好的滿(mǎn)足各種場(chǎng)合的用戶(hù)需求。
MicroLED 微盤(pán)的熒光強度像（3D 顯示）：
測試案例
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